Molekularny mechanizm sprzężenia mechanochemicznego w syntazie ATP | Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej

Syntaza ATP (znana także jako F₀F₁-ATPaza) jest by posłużyć się sformułowaniem Boyera „wspaniałą maszyną molekularną”, odgrywającą kluczową rolę w bioenergetyce komórek eukariotycznych i prokariotycznych, a ze względu na swą złożoną strukturę i wielorakie możliwości inhibicji jest także uważana za atrakcyjny cel komórkowy dla nowych terapeutyków. Główną funkcją biologiczną syntazy ATP w większości komórek jest wykorzystanie gradientu protonów w poprzek błony komórkowej do syntezy ATP zADP i nieorganicznego fosforanu. Z punktu widzenia mechanistycznego syntaza ATP składa się z dwóch połączonych przeciwstawnie rotacyjnych białek motorycznych: osadzonej w błonie części F₀, której zadaniem jest translokacja protonów, oraz peryferyjnej, hydrofilowej części F₁, odpowiedzialnej za katalizę. Części te sprzężone są mechanicznie za pośrednictwem wspólnej podjednostki rotacyjnej złożonej z pierścienia 815 podjednostek c (tzw. pierścień c) oraz wydłużonej superhelikalnej podjednostki γ. Pomimo wielu wysiłków, nie zaproponowano dotąd pełnego mikroskopowego modelu sprzężenia mechanochemicznego w obrębie syntazy ATP, który tłumaczyłby obserwowany wzorzec rotacji podjednostki γ a także niemal idealną wydajność termodynamiczną realizowanej przez enzym konwersji energii.

Celem niniejszego projektu jest zrozumienie mechanizmu działania syntazy ATP na poziomie molekularnym w stopniu umożliwiającym racjonalną konstrukcję nowych, selektywnych inhibitorów enzymu w komórkach drobnoustrojów. W szczególności zamierzamy wykorzystać nowoczesne metody symulacji molekularnych do zbadania mechanizmu konwersji energii w katalitycznej części syntazy ATP oraz do zidentyfikowania różnic w tym mechanizmie pomiędzy różnymi formami enzymu, pozwalających na jego selektywną inhibicję. Dodatkowo zbadamy, czy struktura enzymu daje sposobność rozszerzenia spektrum działania istniejących leków przeciwbakteryjnych hamujących aktywność błonowej części syntazy ATP oraz w jaki sposób związki te interferują w proces translokacji protonów. Powyższe cele zrealizowane zostaną z wykorzystaniem nowoczesnych wieloskalowych metod obliczeniowych i symulacyjnych, które pozwolą na integrację dostępnych w literaturze danych strukturalnych i wyników uzyskanych w eksperymentach na pojedynczych cząsteczkach enzymu. Proponowane badania dostarczą szczegółowych informacji na temat sprzężenia mechanochemicznego w obrębie niezwykle ważnego enzymu, przyczyniając się także do rozwoju innowacyjnych strategii zwalczania infekcji drobnoustrojowych.

W szczególności, projekt zakłada zrealizowanie dwóch głównych zadań badawczych. Po pierwsze, zamierzamy wyjaśnić mechanizm transferu i konwersji energii w obrębie F₁-ATPazy i ustalić, czy pomiędzy homologicznymi wariantami enzymu występują różnice pozwalające na jego selektywną inhibicję. W tym celu wyznaczymy pełny profil energii swobodnej dla pojedynczego cyklu katalitycznego F₁, pozwalający na ustalenie zależności pomiędzy sekwencją zmian obsadzeń centrów aktywnych enzymu z sekwencją zmian konformacyjnych w katalitycznej głowie enzymu oraz położeniem kątowym podjednostki γ. Zakładamy, że uzyskany w ten sposób model mechanizmu pozwoli na rozwiązanie wieloletnich kontrowersji dotyczących sposobu transferu i konwersji energii w obrębie syntazy ATP, w tym na zidentyfikowanie konformacji enzymu w metastabilnych stanach przyjmowanych podczas cyklu katalitycznego. To ostatnie ma szczególne znaczenie dla możliwości projektowania inhibitorów syntazy ATP, tym bardziej że próby zbadania tych konformacji przy pomocy doświadczalnych metod strukturalnych nie przyniosły dotąd zadowalających rezultatów. Po drugie, zmierzamy określić mechanizm aktywności związków hamujących transport protonów przez białko F₀ oraz zbadać możliwości rozszerzenia spektrum działania tych związków na inne klasy ludzkich patogenów. W tym celu zbadamy, w jaki sposób antybiotyk przeciwgruźliczy bedakilina wiąże się w sposób specyficzny ze swoim celem komórkowym, wykorzystując do tego celu rozwiązaną ostatnio strukturę krystaliczną kompleksu leku z mykobakteryjnym pierścieniem c. Na podstawie uzyskanych informacji zbadamy możliwość zoptymalizowania szkieletu bedakiliny w kierunku zwiększenia selektywności wiązania do wybranych form pierścienia c: Gram-dodatniej, Gram-ujemnej i drożdżowej. W ramach tego zadania, zamierzamy także ustalić mechanizm, za pośrednictwem którego inhibitory F₀ hamują translokację protonów. W tym celu skonstruujemy pierwszy pełnoatomowy model kompleksu F₀, wykorzystując do tego opublikowane ostatnio wysokorozdzielcze mapy cryo-EM w połączeniu z Bayesowską metodą udokładniania struktur. Klasyczne i kwantowe symulacje tego modelu pozwolą na wgląd w funkcjonowanie F₀ i ułatwią projektowanie nowych inhibitorów tego enzymu.